ПЦР: 20 лет в медицине и 10 лет в службе крови

       Используя ПЦР, медицина сделала большой прогресс в диагностике и лечении ВИЧ, вирусных гепатитов, генетического полиморфизма, предрасполагающего к раку, кардиоваскулярным и другим заболеваниям.
       В 2004 году на XVII заседании международной рабочей группы ВОЗ по стандартизации технологии геномной амплификации, прежде всего для обеспечения вирусной безопасности донорской крови, ее компонентов и препаратов (SoGAT), отмечалось десятилетие со дня первого NAT-воркшопа в Хельсинки, организованного в 1994 году Национальным институтом биологической стандартизации Англии (NIBSC) и Европейской ассоциацией по фракционированию плазмы (EPFA), на котором была создана рабочая группа SoGAT: "Standartization of qualitative and quantitative nucleic acids tests to contribute to the safety of blood, tissues and organs with regard to blood borne pathogens".
        SoGAT стала международным форумом для всех организаций: контролирующих лабораторий, производителей наборов, производств по фракционированию и референс - лабораторий при соспонсорстве ВОЗ.
        Главным итогом работы SoGAT является создание международных NAT-стандартов на следующие трансмиссивные вирусы: ВИЧ, HBV, HCV, B19, HAV и WNV, и технологии генотестирования донорской крови и плазмы в минипулах.
        Второе преимущество ПЦР в реальном времени состоит в том, что исключается главная причина ложноположительных результатов: рассеивание продуктов амплификации с аэрозолями и персоналом в процессе гель-электрофоретической детекции.
        Третье преимущество метода заключается в быстроте анализа: требуется менее часа для получения результата. Последняя модель высокоавтоматизированной установки ABI Prism 7700 НТ Applied Biosystem позволяет использовать микропланшеты с 384 лунками и проводить около тысячи анализов за рабочий день.
        Четвертое преимущество ПЦР в реальном времени состоит в возможности идентифицировать в продукте амплификации одиночные нуклеотидные замены (Single nucleotide polymorphism - SNP), что стало главной проблемой для всей медицины.
        Генотестирование донорской крови и ее компонентов на вирусы позволяет получить результаты о вирусной безопасности до выдачи их в клиники без превышения допустимых сроков хранения на СПК и в ОПК. Оценка по такому интегральному показателю, как остаточный риск вирусной инфекции у реципиентов, получивших трансфузии, позволила многим странам Европы, США, Австралии, Канаде и Японии приблизиться к очень низкой частоте: один случай инфекции на несколько миллионов трансфузий.

Клиническая лаборатория Центра крови ФМ БА России предлагает следующие виды исследований:

Иммуногематологические:

1. определение групповой и резус-принадлежности
2. типирование антигенов эритроцитов по системам Резус и Келл
3. скрининг антиэритроцитарных аллоантител
4. помощь в сложных случаях диагностики групповой и резус-принадлежности (наличие вариантов антигена A, D)
5. индивидуальный подбор гемокомпонентов для переливания и пробы на совместимость

Серологические:

диагностика сифилиса по двум реакциям (РПГА и МР с кардиолипиновым антигеном)

Общеклинические:

1. клинический анализ крови (9 параметров) на гематологическом анализаторе Medonic Mimer:
   • лейкоциты
   • эритроциты
   • тромбоциты
   • гемоглобин
   • гематокрит
   • средний объем эритроцитов
   • средний объем тромбоцитов
   • среднее содержание гемоглобина в эритроците
   • средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах
2. подсчет лейкоцитарной формулы в мазке крови

Биохимические:

определение уровней АЛТ, общего белка, глюкозы и холестерина в сыворотке крови

        Иммуногематологические исследования производятся как с помощью Цоликлонов на плоскости, так и методом гелевой технологии. Гелевая технология ScanGel - современная технология для определения антигенов эритроцитов, скрининга антиэритроцитарных антител - использует комбинацию методов агглютинации и гель-фильтрации. Все тесты проводятся в пластиковых диагностических карточках, которые содержат микропробирки, заполненные полиакриламидным гелем. Гель может быть нейтральным, либо содержащим специфические моноклональные антитела или антиглобулиновый реагент. Исследуемые эритроциты или стандартные эритроциты и исследуемая сыворотка (плазма) помещаются в соответствующие микропробирки, где происходит реакция агглютинации, затем диагностические карточки центрифугируются для разделения результатов реакции. При этом неагглютинированные эритроциты свободно проходят между частицами геля и образуют осадок на дне микропробирки, в то время как агглютинированные располагаются на поверхности или в толще геля. Положительный результат может быть оценен от 1+ до 4+. Размер частиц геля, специальный подбор моноклональных или поликлональных антител позволяет достичь наилучших результатов чувствительности и специфичности. А его прозрачность делает считывание результатов более надежным и позволяет интерпретировать самые сложные диагностические случаи.

Основные преимущества использования гелевой технологии ScanGel

• высокая чувствительность и специфичность тестов: в основе лежит использование более чувствительного метода агглютинации и гель-фильтрации, а также использование более чувствительных и специфичных моноклональных антител, что позволяет проводить диагностику слабых вариантов антигенов и антител (А2, Du, DVI); единственный метод выявления посттрансфузионных и посттрансплантационных "химер"

• объективизация, стандартизация и возможность хранения результатов исследований

• удобство и простота в исследовании, повышение безопасности персонала: отсутствие этапов отмывания эритроцитов; исследование крови, заготовленной на консервантах и стабилизаторах без искажения результатов; сокращение времени на проведение полного иммуногематологического исследования в 2 - 5 раз; снижение риска заражения персонала инфекциями, передающимися через кровь.

Диагностика гемотрансмиссивных инфекций.

Вирусный гепатит В

Название маркера:
HBsAg (поверхностный антиген вируса гепатита В)

Особенности:
HBsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В, основной маркер острого и хронического гепатита В. В большинстве случаев HBsAg обнаруживается уже в инкубационном периоде и при остром течении гепатита выявляется в крови в течение 5-6 мес. Обнаружение поверхностного антигена вируса гепатита В в крови дольше 6 месяцев после начала болезни свидетельствует о возможной хронизации процесса. Возможно пожизненное носительство HBsAg.

Показания для проведения анализа:

1. Повышение уровня АлАТ и АсАТ;
2. Клинические признаки острого или хронического вирусного гепатита, хронические заболевания печени и желчевыводищих путей;
3. Обследование в очагах заболевания в семье/в коллективе;
4. Подготовка к вакцинации;
5. Обследование хронических больных, подвергающихся частым парентеральным манипуляциям;
6. Подготовка к госпитализации, оперативному вмешательству;
7. Беременные и при подготовке к беременности;
8. Профилактическое обследование доноров, лиц из групп риска (медработники, дети от матерей- носительниц HBsAg);
9. Незащищенные половые контакты, частая смена половых партнеров;
10. Внутривенная наркомания.

Подготовка к исследованию:
взятие крови производится натощак.

Материал для исследования:
сыворотка крови.

Метод определения:
иммуноферментный анализ (ИФА).

Сроки исполнения:
в день обращения

Вирусный гепатит С

Название маркера:
Anti-HCV (антитела к антигенам вируса гепатита С)

Особенности:
Вирусный гепатит С - вирусное заболевание, для которого характерно поражение печени и аутоиммунные нарушения. Проявляется в желтушной (5%) или безжелтушной (95%) формах. Антитела класса М (IgM) начинают вырабатываться через 4-6 недель после инфицирования, их концентрация быстро достигает максимума. Через 5-6 месяцев уровень IgM падает и повышается вновь во время следующей реактивации инфекции. Антитела класса G (IgG) появляются с 11-12 недели после инфицирования, достигают пика концентрации к 5-6 месяцу и сохраняются в крови на более-менее постоянном уровне в течение всего периода болезни и реконвалесценции. Гепатит С передается с кровью и биологическими жидкостями парентеральным, половым и трансплацентарным путями. Группу повышенного риска составляют лица, практикующие внутривенную наркоманию, беспорядочные половые связи, а также медицинские работники, пациенты, нуждающиеся в гемодиализе или переливаниях крови, заключенные. Инкубационный период - 5-20 дней. В конце инкубационного периода повышаются уровни печеночных трансаминаз, возможно увеличение печени и селезенки. Острый период протекает со слабостью, снижением аппетита.

Показания для проведения анализа:

1. Повышение уровня АлАТ и АсАТ;
2. Подготовка к оперативному вмешательству;
3. Парентеральные манипуляции;
4. Подготовка к беременности;
5. Клинические признаки вирусного гепатита;
6. Незащищенные половые контакты, частая смена половых партнеров;
7. Внутривенная наркомания;
8. Холестаз.

Подготовка к исследованию:
взятие крови производится натощак.

Материал для исследования:
сыворотка крови.

Метод определения:
иммуноферментный анализ (ИФА).

Сроки исполнения:
в день обращения

ВИЧ-инфекция

Название маркера:
Антитела к ВИЧ 1 / 2 (anti-HIV)

Особенности:
Вирус поражает преимущественно клетки иммунной системы - Т-лимфоциты. Антитела к ВИЧ начинают обнаруживаться в крови инфицированного человека обычно через 3-6 недель, почти всегда выявляются через 12 недель, в редких случаях они появляются только через несколько месяцев и более после попадания вируса в кровь.

Показания к назначению анализа:

1. Увеличение лимфатических узлов более двух областей;
2. Лейкопения с лимфопенией;
3. Ночная потливость;
4. Резкое похудание неясной причины;
5. Диарея более трех недель неясной причины;
6. Лихорадка неясной причины;
7. Планирование беременности;
8. Предоперационная подготовка, госпитализация;
9. Выявление следующих инфекций или их сочетаний: туберкулез, манифестный токсоплазмоз, часто рецидивирующая герпесвирусная инфекция, кандидоз внутренних органов, повторные невралгии герпес-zoster, вызванная микоплазмами, пневмоцистой или легионеллами пневмония.
10. Саркома Капоши в молодом возрасте;
11. Случайные половые контакты.

Подготовка к исследованию:
Взятие крови производится натощак.

Материал для исследования.
сыворотка крови.

Метод определения:
иммуноферментный анализ (ИФА).

Сроки исполнения:
В день обращения

Кровь для анализа берется в специальные одноразовые вакуумные пробирки для взятия крови, что обеспечивает полную безопасность пациента и медицинского персонала при работе в момент взятия крови, так как полностью исключается контакт крови с окружающей средой.